酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）：是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的實驗技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，幾乎所有的可溶性抗原-抗體系統(tǒng)均可用以檢測。

      一、應(yīng)用

     免疫細(xì)胞胞內(nèi)外成分測定、自身免疫性疾病診斷、體液/組織液中生物分子定量檢測、流行病學(xué)檢測篩查、環(huán)境生態(tài)學(xué)中微量元素定量、病毒滴定檢測、疫苗開發(fā)等。

     根據(jù)樣本及抗原抗體結(jié)合機制，可將ELISA分為四類：直接法、間接法、夾心法、競爭法。

    二、實驗步驟（以夾心法為例）：

• 試劑、耗材的準(zhǔn)備（板子平衡至室溫，buffer的稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品的溶解等）；
• 捕獲抗體的包被（通常為4°C過夜）；
• 洗板，洗去未結(jié)合的抗體；
• 封閉，占據(jù)未被捕獲抗體結(jié)合的空隙（有些試劑盒不需要封閉）；
• 洗板，洗去未結(jié)合的封閉劑；
• 加入樣本或標(biāo)準(zhǔn)品（孵育時間參考說明書）；
• 加入檢測抗體（孵育時間參考說明書） ；
• 洗板，洗去未結(jié)合的檢測抗體；
• 加入酶標(biāo)記的二抗（孵育時間參考說明書） ；
• 洗板，移除多余的二抗；
• 加入底物顯色（參考說明書，具體時間根據(jù)實驗情況調(diào)整）；
• 加入終止液終止顯色（終止后迅速檢測）；
• u 酶標(biāo)儀測吸光值（雙波長檢測更準(zhǔn)確，450nm檢測波長，570nm校正波長）。

   三、IFN-γ在免疫和腫瘤中的調(diào)節(jié)作用:

      ELISA常見檢測指標(biāo)有IFN-γ、TNF-α、IL-17A等。其中干擾素-γ（IFN-γ）是一種可溶性細(xì)胞因子，在1965年被發(fā)現(xiàn)于由PHA刺激的PBMC釋放，隨后因其對先天和適應(yīng)性免疫的多效免疫調(diào)節(jié)作用而聞名。IFN-γ主要由活化的淋巴細(xì)胞分泌，如CD4+和CD8+ T細(xì)胞，γδT細(xì)胞，以及NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞；也可由其他細(xì)胞分泌，包括B細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）。IFN-γ能夠與IFN-γ受體（IFN-γR）結(jié)合，激活JAK信號通路和STAT途徑并誘導(dǎo)IFN-γ刺激基因的表達(dá)。

    IFN-γ通過多種方式發(fā)揮抗腫瘤作用，包括抗原呈遞的調(diào)節(jié)、促進(jìn)炎癥和趨化信號傳導(dǎo)、應(yīng)答白細(xì)胞的激活和極化，以及直接的抗增殖和抗血管生成作用。IFN-γ誘導(dǎo)的CXCL9、CXCL10和CXCL11 可阻斷新血管形成，并招募效應(yīng)白細(xì)胞。同時IFN-γ能拮抗抑制性細(xì)胞因子的表達(dá)（TGF-β、IL-10），并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中IL-12的表達(dá)。此外，IFN-γ還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中凋亡誘導(dǎo)劑（caspase-1、caspase-8、Fas和FasL等）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞可分泌IFN-γ使樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抗原呈遞作用上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞活化所必需的共刺激分子和細(xì)胞因子的表達(dá)。

     另一方面，與抗腫瘤作用相反，IFN-γ還發(fā)揮促腫瘤的作用。這種活性主要是由IFN-γ信號敏感性喪失、抗原呈遞減少以及IDO和檢查點抑制劑的誘導(dǎo)而產(chǎn)生。

1、樣本中分析物水平較低可以使用哪些方法改進(jìn)檢測？

通過增加洗滌次數(shù)和兩次洗滌之間的浸泡時間降低背景。

控制測定精確度。例如，在移液時要更加小心和一致，使用干凈的紙巾拍板，以避免污染。

增加孵育時間。但這通常也會增加背景，因此檢測靈敏度不一定會增加。

如果可以的話，建議濃縮樣本。

使用5-PL曲線擬合方法，更準(zhǔn)確地計算標(biāo)準(zhǔn)曲線下端的樣本濃度。

在大多數(shù)情況下，樣本可能只含有非常低或無法檢測到的分析物水平。這時無論如何操作和測定，仍然無法檢測到準(zhǔn)確濃度。

2、包板應(yīng)如何存放？

如果包被完抗體的板不能立即使用，應(yīng)將其密封并在4°C儲存過夜。

3、為什么使用同一克隆號的捕獲抗體和檢測抗體建立ELISA實驗沒有成功？

如果使用相同的克隆抗體進(jìn)行檢測和捕獲，則抗原表位可能已經(jīng)被其中一種抗體占據(jù)并抑制另一抗體結(jié)合。建議捕獲和檢測抗體選擇不同的克隆號。

4、應(yīng)該使用哪種包被緩沖液？

一般來說，建議使用PBS（pH 7.4）或碳酸鹽緩沖液（pH 9.5）。確切的包被緩沖液可能取決于要檢測的細(xì)胞因子。

5、為什么細(xì)胞因子流式染色與ELISA測定之間沒有良好的相關(guān)性？

流式細(xì)胞術(shù)檢測的胞內(nèi)細(xì)胞因子代表檢測時的陽性細(xì)胞比例，ELISA代表細(xì)胞因子隨時間的積累量。可能少量的陽性細(xì)胞在一段時間之后會分泌大量的細(xì)胞因子于培養(yǎng)上清中,導(dǎo)致ELISA的結(jié)果與胞內(nèi)因子染色的結(jié)果不一致

6、可以使用細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行ELISA實驗嗎？

不可以。細(xì)胞培養(yǎng)板設(shè)計用于達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)目的，通常不具有高蛋白結(jié)合能力。對于ELISA，建議使用具有高蛋白結(jié)合能力的板，例如 Nunc Maxisorp?酶標(biāo)板。

7、血清等樣本可以重復(fù)使用嗎？

不建議重復(fù)使用樣本。為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，樣本應(yīng)分裝儲存，僅供一次性使用。如果重復(fù)使用樣本，需要進(jìn)行額外的驗證實驗，以確保實驗準(zhǔn)確性。

8、在什么步驟中，可以暫停ELISA實驗？可以冷凍板子以備后用嗎？

最好遵循說明書操作，沒有任何可以暫停實驗的步驟。但是，如果一定需要暫停實驗，建議在封閉步驟（包被捕獲抗體后）。可以在孔中加入200 μL封閉緩沖液，并將板在4°C過夜（信號損失最小或沒有）或在-20°C冷凍幾天（可能會對信號產(chǎn)生一些影響）。不建議在第一步進(jìn)行（在4°C用捕獲抗體包被超過16-20小時），因為可能會導(dǎo)致高背景。

9、包被捕獲抗體可以超過過夜的時間嗎？

通常來說，建議在4°C包被16-20小時。較長的孵育時間可能會增加與板結(jié)合的捕獲抗體量，會增加背景。

10、培養(yǎng)基中的酚紅會干擾ELISA測定嗎？

不會，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會干擾ELISA測定的讀數(shù)。

11、對于一些ELISA試劑盒，為什么血清樣本需要稀釋？

血清樣本稀釋可以盡量減少樣本和標(biāo)準(zhǔn)品之間的基質(zhì)差異，以獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

12、如何提高ELISA檢測獲得更好的信號和靈敏度？

增加孵育時間，但這也可能會增加檢測的背景，同時不改變靈敏度。

在孵育步驟中搖動板子。

確保標(biāo)準(zhǔn)品在使用前完全溶解。

在兩次洗滌之間增加浸泡時間，以進(jìn)一步降低背景。

如果可以的話，在450-570 nm處讀板以減去本底。

通過控制移液誤差或使用更大體積的洗滌緩沖液洗滌來改善CV值。

使用5-PL或4-PL曲線擬合方法，而不是線性曲線擬合。